提取过程中的常见问题

  提取方法有柱式法和磁珠法，提取步骤基本类似分为裂解、洗涤和洗脱。核酸提取需要注意的细节较多，一处出错都会导致结果的失败。常见的问题主要有产物得率低、产物降解或者试剂残留。
一：提取的核酸得率低或无
1. 选择与样本相匹配的提取试剂或步骤。
2. 提取试剂要按照说明的保存方式保存，避免有效成分分解，影响提取效果；
3. 样品与试剂使用量的配比要控制在一定范围，避免超过裂解能力；
4. 破碎研磨（匀浆、裂解）一定要充分，研磨（匀浆、裂解）不充分易引起核酸释放少，从而导致提取效率低下。如果发生这种情况，可以适当延长研磨（匀浆、裂解）的时间。
5. 洗涤缓冲液使用前必须加入乙醇，乙醇含量低会影响洗涤效果导致核酸得率低下。
6. 在洗脱的步骤，洗脱液的使用量太少会导致洗脱不充分，浓度偏低。而洗脱液太多使核酸浓度被稀释，而引起浓度较低。要选择适量的洗脱液用量。
7. 磁珠法提取核酸时，洗脱时一定要充分混匀磁珠，使磁珠处于完全分散状态，否则影响洗脱效果，从而导致提取效率降低。
二：提取核酸出现降解
1. 避免反复冻融样品，推荐使用新鲜样品或只解冻过一次的样品；
2. 长期保存的样品，应选择适当的保存条件，避免保存不当造成的核酸降解。
3 操作时间过长，或环境温度较高导致核酸（特别是）降解。
4. 在洗脱时温度过高，核酸有可能会降解；
5. 琼脂糖凝胶电泳过程中，凝胶和电泳液最好新鲜配制，以避免陈旧电泳液导致电渗、电流过大、发热等现象导致的核酸特别是RNA的降解；
6. 电泳槽电泳前也用去RNase水清洗，避免RNase残留导致RNA降解；。
三：提取到的核酸纯度不够高，甚至抑制物残留影响下游实验
1. 样本量和试剂的使用比例不对、研磨（匀浆、裂解）不充分，导致蛋白被膜或磁珠吸附过多；
2. 离心后需要吸取上清时吸取到了沉淀；
3. 操作过程中特别是洗脱时，吸附柱或磁珠被试剂污染。
4. 洗涤不充分导致离子（蛋白）残留；
5. 洗涤后晾干时间不足，导致乙醇残留，抑制下游实验。